本发明涉及一种鸡胚胸肌成肌细胞的分离培养方法。发明利用胰蛋白酶消化剪碎后的鸡胚胸肌到成肌细胞培养，短时间胰蛋白酶消化不会对成肌细胞活性造成明显损伤，可以得到活性较好的成肌细胞；结合采用差速贴壁法，进一步提高了细胞纯度；原代成肌细胞培养24h后细胞即可贴壁，48h后即可长满培养皿80％以上进行传代；细胞生长旺盛，获得的细胞具有分化为肌纤维和肌肉的能力，可为探究肉鸡肌纤维生长和分型等肌肉发育调控的机理研究提供实验材料。