本发明涉及分子鉴定技术领域，具体而言，涉及一种山葡萄种质资源的鉴定方法及其应用，所述方法包括以下步骤：扩增待测样品的psbA‑trnH和/或ITS2序列片段并测序；参照不同已知山葡萄种的psbA‑trnH和/或ITS2条形码序列进行序列比对，以确定待测样品的山葡萄种。本发明提供的山葡萄种质资源的鉴定方法将psbA‑trnH序列与ITS2序列相结合，将psbA‑trnH序列作为山葡萄种质资源的DNA条形码序列，同时将ITS2序列作为psbA‑trnH序列的补充序列，来提高山葡萄种质资源的鉴别效率，可用于山葡萄的种间和种内资源的鉴定。